采样、包装和运输

 

采样

ASF 的任何实验室检测都始于样品采集。样品采集过程中重要的考虑因素是调查的目的，例如诊断、监测或无疫认证。对哪些动物采样将取决于抽样的目的。例如，当调查疫情爆发( 被动监测) 时，应对针对患病和死亡动物，而在检查动物是否暴露于病原( 主动监测) 时，应对年龄最大的动物进行抽样。

负责抽样( 并进行临床检查) 的人员在开展相关操作前应该接受过保定猪的技术培训( 包括临床检查和取样)。

采样小组应根据采样动物的数量准备充足的采样设备( 见插文4)，并包含可能由于其他原因( 例如，失效的真空采血管) 而丢失或不可用的材料数量。另外，数据收集、个人防护/ 生物安全和样品运输的物品必须包装( 参见插文4 中的“样品运输材料”)。

建议准备一份现场采样表格，以便将现场收集所有样品和相关信息统计到一起。如果预期将样品提交给区域/ 国际参考实验室，建议一式两份取样，以便对提交的样品进行留样，避免在反复冻融/ 分割样品。

取样应小心谨慎，并按照适当的方法避免对动物造成过度的应激或伤害，或对采样人员造成伤害。应无菌收集并注意避免交叉污染，并始终使用新的针头以避免疫病传播。所有等待检测的样品都应该被认为有感染性并应进行相应处理。养殖场使用的所有采样材料应按照当地法规进行安全处理，例如，装袋并运送回实验室进行高压灭菌/ 适当处置。

提交到诊断实验室的相关样品应有清晰且保存持久的标签，样品质量良好。

样品类型

a) 全血

使用含有抗凝血剂(EDTA - 紫色盖) 的无菌管( 真空采血管) 从颈静脉、下腔静脉或耳静脉抽取全血。如果动物已经死亡，可以从心脏中采血，但必须立即进行。

避免使用肝素( 绿色盖子)，因为其可以抑制PCR 反应(造成假阴性)，和/ 或由于红细胞吸附试验(HAD) 造成假阳性的产生。血液是PCR 检测和病毒分离的目标样品。通过离心分离出的血浆可以用间接免疫过氧化物酶试验(IPT) 或间接荧光抗体(IFA) 试验进行抗体的检测。

 

通过干血斑(DBS) 进行微量体积血液样品的采集和储存，以便进一步进行DNA和/ 或抗体检测。这些卡片在偏远地区或者在无法冷链运输的时候很有帮助，比如在热带地区的狩猎环境和农村地区。然而，使用干血斑(DBS) 进行非洲猪瘟检测时，基因组和/ 或抗体检测测试的灵敏度低于全血或血清样品。通过将几滴由刺血针或无菌注射器针头从动物的静脉或皮肤滴加到特制的吸水滤纸中完成干血斑(DBS) 样品的收集。血液样品应该完全浸透在滤纸，并风干数小时。将样品储存在低透气性的塑料袋中，加入干燥剂以减少湿度，即使在热带气候下也可以保持在环境温度中。

b) 血清

使用未加抗凝剂( 红色盖子) 的真空采血管从颈静脉、下腔静脉、耳缘静脉，或剖检过程收集血液样品。返回实验室后，血液样品应在4±3℃下放置14-18 小时以分离血凝块(译者：此处与我国实际操作不同，仅供参考)。弃去凝固物，并离心10-15 分钟后，回收澄清的上清液( 血清)。如果血清是红色，这表明样品发生了溶血，可以在酶联免疫吸附试验(ELISA) 中产生假阳性反应。通常已经死亡动物的血液样品易发生溶血( 例如野猪)。血清样品在分离后可以立即开展抗体和病毒检测，或者在<-70ºC 下储存备用。对于抗体检测，储存在-20℃已足够，但是对于病毒检测，最好存于更低温度。

c) 器官和组织样品

虽然所有的猪器官和组织都可以用来检查ASFV 的存在( 主要是该病的急性和亚急性的形式)，但目标器官是脾脏、淋巴结、肝脏、扁桃体、心脏、肺和肾脏。

其中，脾脏和淋巴结是最重要的，因为通常它们的病毒含量是最高的。骨髓也可用于死亡野生动物病例，因为如果动物已经死了一段时间，则骨髓可能是唯一相对保存完好的组织。可以通过关节内组织液以检查低毒力毒株的存在。建议将样品保持在4℃，尽快(48 小时内) 提交给实验室。如果由于物流原因无法保障的，样品可以储存在冷库或液氮中。对于组织病理学研究，也可以同时提交用10% 缓冲福尔马林浸泡的样品。虽然这些样品不能用于进一步的病毒分离研究，但可用于PCR 反应和免疫组织化学试验。

通过PCR 反应、病毒分离和/ 或抗原检测ELISA 的方法进行病毒检测时，需要将样品用磷酸盐缓冲液制备成10%(w / v) 的均质组织悬液。在离心后，建议对上层清液进行过滤，并用0.1% 的抗生素在4±3 ºC 处理1 小时。经过匀浆处理组织可以立即用于ASFV 病毒和/ 或核酸的检测，或存储在< -70ºC 备用。对于PCR 反应，建议对10 倍稀释样品或上清进行检测的同时，对未稀释样品也进行检测。从脾脏、肝脏和肺等脏器中提取的渗出物对于使用免疫过氧化物酶试验(IPT) 和间接荧光抗体试验(IFA) 方法检测抗体非常有用(Gallardo，2015)。

d) 软蜱样品

钝缘蜱属软蜱可以用于检测ASFV 和病毒基因组。可从疣猪的洞穴、裂缝/ 洞穴中收集蜱虫，有时也可以从猪圈内的啮齿类动物的洞穴中收集。不同种类的蜱会有不同偏好的场所和栖息地。有三种收集技术：手动收集、二氧化碳诱捕和真空吸引捕捉。收集后，应让蜱保持存活或直接储存在液氮中，以确保蜱内病毒的保存完好，并避免DNA 降解。

 

包装和运输样品

为了获得正确的诊断，必须在适当的温度下、以最快的速度正确采集样品。仔细进行包装、做好标记并送到实验室。ASF 的诊断紧急，样品必须通过最直接的路线送到最近的有资质的实验室。样品必须附有一份提交表格，具体说明样品的数量和类型、种类、采样地点( 根据具体情况填写地址、县、区、省、来源国家等信息)。此外，还列出了所需要的检测项目、提交样品人的姓名，以及观察到的临床症状、病变、发病率、死亡率、受影响动物的数量、历史和动物种类。如果是家畜，应该标注养殖场的所有者、养殖场的名称和饲养模式，再加上需进行的鉴别诊断项目列表。每个样品应能对应到来源动物。填写信息最低要求可能因实验室而异。采样之前打电话给实验室，有助于确保遵循正确的提交程序，以保证所送样品的数量能在一定时间内能够完成分析及储存。

样品应尽快到达检测实验室，以避免变质并确保最佳效果。应该保障运输过程中的安全，以免在运输途中感染其他动物或人，并避免污染样品本身。运送的样品必须有足够数量的冷却材料，例如冰袋，以防止变质。如果样品状况不佳，则无法做出准确的诊断。

陆地运输

将样品运送到最近的实验室时，即使样品由兽医服务人员携带，也必须遵守国家规定。如果没有可用的规定，应遵循《OIE陆生动物诊断和疫苗手册》中所述的联合国示范条例2 (2016 年;第1.1.2 和1.1.3节)。即使在公路运输的情况下也应使用三重包装。图27 列出了三重封装特性的详细例子。

 

航空运输

这些样品应该按照规定3 运输，并使用“三重包装系统”。特别是如果样品通过空运运输，发货人必须遵守国际航空运输协会(IATA) 的《危险品条例(DGR)》，包装应符合《危险品条例(DGR)》中的第6504 条包装说明。

非洲猪瘟的诊断样品被认为是危险的 — 必须被包装，并正确标记，以防止病毒的泄漏。因此，应使用满足规格的产品( 即符合国际航空运输协会(IATA) 运输诊断样品的要求，如95KPa 压力测试，跌落试验)。要寻找该类型容器和包装的供应商，请在互联网搜索关键字，如“95 KPa”和“UN3373”、“瓶”、“管”、“袋子”，则通常会找到适当的信息。

• 主要的容器. 样品应该储存在防漏、防水、无菌的容器中( 这些应该是主要的容器)，如图27 所示。每个主要容器不得超过1 升。每个容器的盖子应用胶带或石蜡膜密封。这些密封的主要容器应该是用减震/ 吸收材料单独包装，以吸收容器或管子任何可能的泄漏，并防止冲击。必须用防水墨水标记每个容器，以明确识别来自于哪只动物。

• 二次包装.所有这些主容器应放置在二次防漏、密封、防水的容器中，材质可以为塑料或金属。二次包装必须能够承受-40℃至55℃的温度范围，耐受95 KPa(0.95 bar)的内部压力，且无泄漏。吸收材料也应放置在二次容器内。如果将多个易碎的主容器放置在单个二次容器中，则必须单独包装或分离，以防止相互接触。

注意1)由于存在发生爆炸的危险，请勿将干冰放入主容器或二次容器内。2)主要容器必须能够承受-40℃至55℃的温度范围5，耐受95 KPa(0.95 bar)的内部压力，且无泄漏。

• 坚硬的外部包装. 二次容器必须确保用合适的缓冲材料外包装。应该已经成功地通过了在1.2 米的高度的跌落测试，并标有UN3373 标记。外包装在盛装液体的情况下不得超过4 升，在固体物质的情况下不得超过4 公斤。当冷藏样品时，不包括冰、干冰或液氮的重量。

样品必须在4℃温度运送，通常为短期运输（1-2 天）

如上所述进行包装，如果空运，应根据国际原子能机构(IAEA)包装规范650，将样品与制冷剂(足够的数量以保持所需的温度)放置在隔热、坚固的箱子进行运输。

必须冷冻运输的样品（-20℃或-70℃）

对于超过三天以上的运输：这些材料也应按指定的方式包装，并在隔热箱中添加足够的干冰以保持温度。确保二次包装在箱子的中心是固定的，这一点很重要，因为当干冰分解的时候，二次容器会松动。由干冰分解产生的二氧化碳气体(CO2)降低PH 值并使病毒灭活;因此，所有主要和二次容器必须密封。当干冰被用来在运输过程中冷藏样品时，外部包装必须允许释放气体(即不能密封)以防止压力的积聚，从而破坏包装。切勿冻结全血或含凝血剂的血清。

1. 标签和标记

箱体外部(刚性外包装)应标有以下标识 ：

1.“B 类生物物质”标签(图28)，其正确的运输名称旁边标注“B 类生物物质”;

2. 发件人的全名、地址和电话号码;

3. 收件人的全名、地址和电话号码;

4. 了解运输情况的负责人员的全名和电话号码，如，负责人：姓名、+电话号码;

5. 标签上标明“在4 摄氏度”或“在零下70 摄氏度”保存。如果使用了干冰;

6. 贴有“干冰”标签(图29);

7. 联合国(UN) 编号和带有干冰的正确运输名称，后附有“作为冷却剂”。干冰的净数量(千克)必须清楚地写在图29 周围，例如，UN1845、干冰、作为冷却剂、净重，## 千克。

2. 文件

运往实验室的样品必须附有该实验室提供的申请表格，或者，如果不能提供，则提供附信。该信件应包括有关动物所有人、养殖场名称、养殖场的所在地、饲养模式、涉及动物、病史、临床体征和死后病变的相关信息。必须注明所需的检测项目。

运输单据：如果跨国境运输，需要进口或出口许可证，以及实验室接受传染性物质诊断许可证的副本等(有时需要)。这些要求因国家而异。询问接收方实验室进口诊断样品是否需要上述相关文件。

3. 运输

在运输样品前，请尽早与接收实验室联系并通知其有关预期的装运，包括详细信息和大致的到达日期和时间。最好是安排送货上门服务，直接送到实验室。一旦派送样品，快递员应向目的地实验室提供其公司名称，如果有的话，应提供货物的跟踪号码和/ 或空运单号。如果使用空运，有必要与接收实验室事先安排，在抵达机场时接收货物(一些国际实验室有该系统，但也不是全部都有)。必须告知接收实验室航空公司的名称、航班号和航空运单号。严禁人员将传染性物质放入托运或手提行李中，严禁随身携带传染性物质。

运输分离/ 培养的非洲猪瘟病毒

分离/ 培养的ASF 病毒必须按照A 类感染性物质运输。联合国的编号是UN2900，正确的运输名称是“感染动物的传染性物质(非洲猪瘟病毒)”，并符合第620 号包装要求。箱子外面的标签和标记也是不同的。

《危险品条例》要求所有参与运输的人员进行适当的培训，特别是对A 类具有传染性的物质的运输，人员必须按照相应的要求进行培训，包括参加批准的课程、通过考核和获得认证(有效期为两年)。有关更多信息，请参阅《世卫组织传染病运输条例指南》。

 

 

 

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